В данной статье анализируется взаимосвязь между параметрами времяпролетной масс-спектрометрии (TOF MS) и характеристиками АЦП. АЦП со смешанным фронтом сигнала (MxFE®) демонстрируют, что малошумные высокоскоростные АЦП могут значительно улучшить показатели времяпролетной масс-спектрометрии, включая точность измерения массы, разрешение по массе и чувствительность.

Введение в времяпролетную
масс-спектрометрию (ВТМС) — это аналитический метод количественного определения известных и неизвестных молекул в образце на основе молекулярной массы. Ионизация элементов и/или молекул в образце в газообразные ионы, с фрагментацией или без нее, и последующее их разделение в масс-анализаторе позволяют охарактеризовать элементы и/или молекулы по их отношению массы к заряду (m/z), или положению импульса, и относительной распространенности, или амплитуде импульса, в масс-спектрах.
Масс-спектрометр состоит из трех основных компонентов: источника ионов для получения газообразных ионов из исследуемого образца, масс-анализатора для разделения ионов в соответствии с их отношениями m/z и ионного детектора для обнаружения ионов и относительной распространенности каждого ионного вида. Выходной сигнал детектора обрабатывается и оцифровывается для получения масс-спектра. Существует несколько масс-анализаторов с принципиально разными стратегиями разделения ионов с различными значениями m/z. На рисунке 1 показаны основные составляющие квадрупольной масс-спектрометрии (МС) и времяпролетной (ВПР) спектроскопии.
В ВПР-МС ионы, образующиеся в результате короткого события ионизации, ускоряются электростатическим полем таким образом, что ионы с разными значениями m/z имеют одинаковую кинетическую энергию, но разные скорости. Затем ионы движутся по дрейфовой траектории без поля и достигают детектора с разным временем пролета: более легкие ионы прибывают раньше более тяжелых, как показано на рисунке 2. На практике время пролета пакета ионов с одинаковым m/z распределяется таким образом, чтобы сформировать импульс, который может быть очень узким, всего несколько сотен пикосекунд (пс), из-за различий в начальном пространственном распределении и энергии (или скорости) в области ускорения. Каждый импульс представляет собой сумму сигналов, соответствующих нескольким независимым событиям прибытия ионов, и часто характеризуется параметром ширины на половине максимума (FWHM).

Рисунок 1. Основные блоки квадрупольного масс-спектрометра и времяпролетного анализатора.

Рисунок 2: Иллюстрация времяпролетного масс-анализатора.

Детектор, например, микроканальный детектор (MCP), обнаруживает поступающие ионы и генерирует импульсный электрический ток. Этот электрический ток регистрируется с помощью время-цифрового преобразователя (TDC) или высокоскоростного цифро-аналогового преобразователя (DAC). Хотя TDC может работать чрезвычайно быстро, до нескольких пикосекунд, он имеет ограниченный динамический диапазон для записи амплитуды импульса. Высокоскоростные АЦП могут достигать 2 или более гигавыборок в секунду (GSPS) с разрешением в 10, 12 или даже больше бит, что позволяет точно регистрировать как время, так и амплитуду импульса. Мы обсудим важные характеристики высокоскоростных АЦП, влияющие на производительность сканирования времяпролетной масс-спектрометрии (TOF).

Применение времяпролетной масс-спектрометрии (TOF MS):
технология MALDI ионизирует молекулы матрицы, как правило, органические кислоты, и одновременно испаряет молекулы образца с помощью ультрафиолетовых (УФ) лазерных импульсов длительностью от сотен пикосекунд до нескольких наносекунд (нс). В газовой фазе молекулы матрицы передают протоны молекулам образца, протонируя их и превращая в заряженные ионы. Поскольку матрица поглощает большую часть энергии лазера, молекулы образца сохраняют свою целостность без фрагментации или разложения, что делает MALDI наиболее привлекательным методом ионизации для анализа биологических макромолекул. Благодаря простоте сопряжения MALDI и TOF MS, неограниченному диапазону масс, высокой чувствительности и высокой производительности, TOF MS стала незаменимым инструментом для биомедицинских исследований, разработки лекарств и клинических применений, где аналитами часто являются макромолекулы.

В частности, MALDI-TOF MS играет незаменимую роль в клинической идентификации бактерий благодаря более быстрому времени выполнения анализа — 4 часа, по сравнению с более чем 72 часами для традиционных или других новых технологий.³ Короткое время выполнения анализа имеет решающее значение для лечения и результатов лечения пациентов, страдающих бактериальными инфекциями. Другие преимущества MALDI-TOF MS включают простоту подготовки образцов, низкие эксплуатационные расходы и возможность идентификации некоторых редких бактерий. Учитывая, что устойчивость к противомикробным препаратам представляет серьезную угрозу для здоровья человека во всем мире, наблюдается растущая тенденция к использованию MALDI-TOF MS в качестве портативного устройства для экспресс-диагностики.⁴

Ключевые параметры времяпролетной масс-спектрометрии (TOF MS):
Способность TOF MS количественно определять различные аналиты в образцах зависит от многих факторов, включая выбор метода ионизации образца, конфигурацию и временные характеристики электрических полей, используемых для ускорения и направления ионов к ионному детектору, эффективность детектора и оцифровку сигнала. Мы ограничимся обсуждением ключевых характеристик TOF MS, связанных с оцифровкой сигнала, включая диапазон масс, точность измерения массы, разрешение по массе, частоту повторения и чувствительность.
Диапазон масс — это диапазон молекулярных масс молекул образца, и он зависит от нескольких факторов, таких как ускоряющее напряжение, длина пролетной трубки, частота дискретизации и частота повторения. Требования к диапазону масс варьируются в зависимости от области применения. Например, идентификация бактерий с помощью MALDI TOF MS измеряет рибосомальные маркеры в диапазоне масс от 2000 Да до 20000 Да.
Поскольку масса рассчитывается по времени пролета, точность измерения массы времяпролетной масс-спектрометрии (TOF) в основном определяется точностью измерения времени импульсов. На практике время прихода каждого импульса рассчитывается путем аппроксимации импульса гауссовой функцией и нахождения пика. Частота дискретизации АЦП определяет количество отсчетов для отдельного импульса и имеет решающее значение для аппроксимации импульса.
Разрешение по массе — это мера минимального различимого расстояния между двумя соседними импульсами в спектре. Оно часто определяется как отношение массы иона к ширине соответствующего импульса массы. Типичным определением ширины импульса является полная масса (FWHM). Чем уже импульс, тем выше разрешение по массе, что означает лучшую дифференциацию между двумя ионными пакетами с похожими молекулярными массами. Хотя разрешение по массе может быть значительно улучшено за счет ортогонального ускорения и рефлекторов, частота дискретизации АЦП и шумовые характеристики также влияют на эту ключевую характеристику.
В времяпролетной масс-спектрометрии (TOF) масс-спектр представляет собой сумму сигналов от множества повторений, а не от одного переходного процесса, охватывающего один процесс ионизации, ускорения и дрейфа, а также детектирования и оцифровки ионов. Крайне важно отметить, что для анализируемых образцов, содержащих множество молекул с различной молекулярной массой и концентрацией, одно событие ионизации может не привести к образованию ионов от всех интересующих молекул, а также не в пропорциях, соизмеримых с их концентрациями. Суммирование является эффективным и практичным методом уменьшения этой ошибки выборки и улучшения отношения сигнал/шум (SNR). Поэтому частота повторения является важной и практичной характеристикой времяпролетной масс-спектрометрии (TOF MS) для SNR и пропускной способности.
Новейшие приборы TOF MS могут достигать скорости развертки 1 кГц или выше, что означает, что каждый переходный процесс длится 1 миллисекунду (мс) или меньше. Увеличение частоты дискретизации АЦП сокращает длительность каждого переходного процесса, обеспечивая более высокую скорость обновления.
Чувствительность TOF MS — это способность обнаруживать молекулы с наименьшими концентрациями в образцах. Она определяется множеством факторов, таких как фоновый химический шум, диапазон концентраций всех интересующих молекул, коэффициент шума и динамический диапазон детектора и АЦП, а также количество переходных процессов, суммируемых для получения конечного масс-спектра. На практике чувствительность системы можно оптимизировать путем выявления фактора, являющегося узким местом, и/или балансировки этих факторов.

Требуемые характеристики АЦП для времяпролетной масс-спектрометрии (TOF MS):
Низкошумящий высокоскоростной АЦП имеет решающее значение для производительности системы TOF MS. Как обсуждалось ранее, точность синхронизации и уровень системного шума являются двумя важными характеристиками для прибора TOF MS. Хотя системный шум можно уменьшить путем суммирования повторных измерений, точность синхронизации определяется частотой дискретизации и дрожанием апертуры высокоскоростного АЦП. Учитывая, что импульсы могут быть очень узкими, всего несколько сотен пикосекунд, в приборе TOF MS с ортогональным ускорением и рефлектором, для отдельного импульса имеется лишь несколько выборок при частоте дискретизации 5 Гвыб/с.
Каждая выборка имеет решающее значение для нахождения пика импульса при аппроксимации выборок гауссовой функцией. Следовательно, частота дискретизации и дрожание апертуры являются желательными характеристиками АЦП.
Чувствительность определяется уровнем системного шума, который можно улучшить путем суммирования повторных измерений. Однако количество повторений ограничивает производительность прибора. Шумовые характеристики АЦП важны для достижения желаемой чувствительности при меньшем количестве повторений. Часто бытует ошибочное мнение о производительности АЦП, что его отношение сигнал/шум (SNR) пропорционально его битовому разрешению. АЦП с частотой дискретизации 1 Гвыб/с или выше обычно используют конвейерную архитектуру и имеют характеристики, включающие эффективное число бит (ENOB) и плотность шума/коэффициент шума/SNR и т. д. Однако АЦП с последовательным соединением не могут достичь битового разрешения, поскольку имеют ряд недостатков, которые способствуют шуму, таких как необходимость использования операционных усилителей с высоким коэффициентом усиления и высокой полосой пропускания для уменьшения ошибок, несоответствие емкостей и рассеивание мощности входного каскада операционных усилителей и усилителей выборки и хранения (S/H).⁵ ENOB зависит от входной частоты и частоты дискретизации и рассчитывается с использованием отношения сигнал/шум и искажений (SNDR). Например, 12-битный AD9081 имеет 8-битное значение ENOB при 4 Гвыб/с и входной частоте 4500 МГц. ENOB не является хорошим показателем шумовых характеристик АЦП.
Плотность шума на шаг ближе к практическому уровню шума, но тестирование с использованием гауссовых импульсов сохраняет основные характеристики шума АЦП и, следовательно, чувствительность прибора TOF MS.

Тестирование малошумного высокоскоростного АЦП:
MxFE предлагает интеллектуальную интеграцию радиочастотных АЦП, цифро-аналоговых преобразователей (ЦАП), встроенной цифровой обработки сигналов и тактовой петли/фазовой автоподстройки частоты (ФАПЧ) для многокристальной синхронизации. Также доступны микросхемы MxFE только с высокоскоростными АЦП. Для простоты в нашем тестировании использовался AD9082, который имеет интегрированные АЦП и ЦАП, как показано на рисунке 3. Интегрированный ЦАП использовался для генерации входного сигнала. Этот ЦАП генерировал узкую последовательность гауссовых импульсов с полупериодом 0,5 нс и амплитудой, управляемой комбинацией цифрового масштабирования и внешних аттенюаторов. Гауссовы импульсы гораздо ближе к сигналу масс-спектра, чем типичный однотональный сигнал, используемый для характеризации АЦП. Для оцифровки сигнала настроены два канала АЦП: CH1 для различных амплитуд насыщения или ослабления путем изменения внешних аттенюаторов, и CH2 в качестве эталонного для уровня сигнала выше 90% от полной шкалы (FS) без насыщения. В нашем тесте частота дискретизации составляла 6 Гвыб/с для получения достаточного количества отсчетов для каждого импульса.

Рисунок 3. Блок-схема для тестирования высокоскоростного АЦП с использованием AD9082.

Были проведены три типа тестов:
Тесты на затухание и насыщение: CH2 с парой фиксированных аттенюаторов 7 дБ в качестве эталона; CH1 с аттенюаторами 8 дБ, 9 дБ и 10 дБ для тестов на затухание и аттенюаторами 3 дБ и 1 дБ для тестов на насыщение.
Измерение слабых сигналов с затуханием до 20 дБ: CH2, подключенный непосредственно к выходу ЦАП в качестве эталона с масштабированием -16 дБFSC; CH1 с парой аттенюаторов 10 дБ для сигнала.
Измерение шума: CH2 с парой фиксированных аттенюаторов 7 дБ в качестве эталона; CH1 с оконечным сопротивлением 50 Ом.
Для каждого теста собирались данные длительностью более 10 мкс, и сбор данных повторялся 10 раз для проверки воспроизводимости. Данные были построены и проанализированы в MATLAB®. 10 повторений были выровнены и построены для каждого тестового случая. На рисунке 4 показан одиночный импульс в тесте, где уровень сигнала CH1 на 3 дБ ниже, чем CH2. 10 повторений хорошо совпали для обоих каналов, что демонстрирует высокую воспроизводимость сбора данных.

Рисунок 4. Перекрытие 10 повторений продемонстрировало высокую воспроизводимость сбора данных.

АЦП AD9082 имеет схему защиты от перегрузки, которая активируется, если амплитуда входного сигнала превышает верхний предел. При активации схемы защиты на спадающем фронте импульса часто возникает восстановительный хвост, что приводит к обрезанию пика на уровне FS и восстановительному хвосту.
Более короткий восстановительный хвост важен для точных измерений времени пролета (TOF) и массы для измерений времени пролета (TOF). На рисунке 5 показан график пяти случаев с насыщением (до 6 дБ) или ослаблением.
Для проверки производительности АЦП при слабом входном сигнале мы получили сигнал, ослабленный на 10 дБ и 20 дБ, как показано на рисунке 6. Чистый сигнал был получен на уровне 10% от FS или ослаблен на 20 дБ, что указывает на минимальный уровень шума, вносимого АЦП.
Для подавления фонового шума АЦП канал CH1 был подключен к терминатору 50 Ом, в то время как канал CH2 оставался на уровне >90% от полной шкалы, как показано на рисунке 7.
Мы проанализировали данные о шуме, построив гистограмму и рассчитав ее стандартное отклонение, как показано на рисунке 8. Стандартное отклонение в этом случае составило 0,0025, что указывает на отношение сигнал/шум 52 дБ на полной шкале.

Рисунок 5. Перекрытие 5 тестовых случаев с насыщением или чрезмерным ослаблением.

Рисунок 6. Тестовые примеры с ослаблением входного сигнала на 10 дБ и 20 дБ.

Рисунок 7. Измерение фонового шума при подключении канала CH1 к терминатору 50 Ом.

Рисунок 8. Гистограммы измерения фонового шума (CH1, слева) и сигнала FS (CH2, справа).

Для дальнейшей количественной оценки точности синхронизации и шумовых характеристик мы сегментировали каждый импульс, центрируя его пик в 30-нс окне. Затем мы аппроксимировали каждый импульс гауссовой моделью для измерения его полной длины волны (FWHM). В качестве базовой линии для расчета шума мы использовали данные за 12 нс с каждой стороны, или 24 нс в общей сложности, 30-нс окна.
На рисунке 9 показан полный график сбора данных для тестового случая с одиночным импульсом, входным сигналом 10% от полной шкалы, увеличенным масштабом, гауссовой аппроксимацией и сегментированной базовой линией. В таблице 1 показаны средние и измеренные значения FWHM, а также рассчитанное отношение сигнал/шум (SNR).

Рисунок 9. Сегментация импульса и базовая линия для измерения FWHM и SNR для тестового случая с входным сигналом 10% FS.

Таблица 1. Измерения FWHM и SNR для тестового случая с 10% FS на входе

Таблица 2. Измеренные значения FWHM и SNR

Обсуждение и заключение:
С установлением MALDI-TOF MS в качестве стандарта для идентификации бактерий в клинических микробиологических лабораториях и растущим интересом к протеомике для персонализированной медицины, ожидается, что MALDI-TOF MS продолжит свой рост в здравоохранении в ближайшие десятилетия. TOF MS также имеет широкое применение в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств, безопасности пищевых продуктов и мониторинге окружающей среды благодаря своему преимуществу в работе с интактными молекулами с широким диапазоном молекулярных масс. Благодаря превосходным шумовым характеристикам и частоте дискретизации в 3–6 раз выше, чем у АЦП текущего поколения приборов TOF MS, малошумный высокоскоростной АЦП является критически важным компонентом следующего поколения высокопроизводительных приборов TOF MS. Высокая частота дискретизации позволяет уменьшить габариты прибора TOF MS без ущерба для производительности, поскольку это может уменьшить длину пролетной трубки и, следовательно, нагрузку на вакуумную систему. Меньшие габариты важны для применения в условиях оказания медицинской помощи и различных полевых применений TOF MS.

В наших тестах AD9082 есть ограничения, включая ограниченную доступность внешних аттенюаторов для создания тестовых случаев с низкоамплитудными входными сигналами (например, 1% от полной шкалы или ослабление 40 дБ), несоответствие импедансов, вызывающее отражение данных, и открытое пространство без экранирования от электромагнитных помех. Заявленное отношение сигнал/шум (SNR) в тестовых случаях было ниже фактического значения, поскольку отражение от базовой линии, вызванное несоответствием импедансов, не было учтено при расчете шума. Для более интенсивного тестирования доступны тестовые платы MxFE с графическим пользовательским интерфейсом (GUI). Подробные инструкции с демонстрацией в реальном времени могут упростить настройку системы оценки заказчика. Прототипирование с использованием образцов MxFE легко осуществить под руководством опытной группы разработчиков.
Измеренные значения FWHM и SNR демонстрируют превосходную временную точность и шумовые характеристики АЦП MxFE. Доступная на рынке частота дискретизации MxFE до 10 Гвыб/с обеспечивает гибкость, необходимую для проектирования датчиков MS TOF следующего поколения с улучшенной точностью и разрешением измерения массы, повышенной чувствительностью и еще меньшими габаритами. Кроме того, АЦП MxFE поддерживаются источниками питания, синхронизирующими устройствами и контроллерами, которые помогают обеспечить бесшовную интеграцию и оптимизацию системы.

Список литературы:
1. Юрген Х. Гросс. Масс-спектрометрия: учебник, 3-е издание. Springer, 2017.
2. Ева Торрес-Сангиао, Кристина Леал Родригес и Карлос Гарсия-Риестра. «Применение и перспективы масс-спектрометрии MALDI-TOF в клинических микробиологических лабораториях». Microorganisms, том 9, 2021.
3. Мохаммад Й. Ашфак, Дана А. Да'на и Мохаммад А. Аль-Гути. «Применение MALDI-TOF MS для идентификации бактерий окружающей среды: обзор». Journal of Environmental Management, том 305, 2022.
4. Э. Шабриер, Х. Бассен, М. Дранкур и К. Сохна. «MALDI-TOF MS и экспресс-диагностика являются революционными диагностическими инструментами в Африке». Новые микробы и новые инфекции, том 26, 2018 г.
5 Чун С. Ли. Диссертация: Повышение точности и энергоэффективности конвейерных аналого-цифровых преобразователей. Мичиганский университет, 2010 г.
Об авторе:
Гуйсюэ (Глен) Бу — инженер-проектировщик/архитектор систем в группе решений для приборостроения, специализирующийся на исследованиях и разработках в области создания и применения научных приборов. Он присоединился к Analog Devices в сентябре 2018 года. Он получил степень бакалавра инженерных наук в Университете Цинхуа, а также степени магистра и доктора наук в Университете Пердью, все по специальности «Биомедицинская инженерия».

Автор: Гуйсюэ (Глен) Бу, инженер-проектировщик систем в компании ADI