Este artigo analisa a relação entre os parâmetros de espectrometria de massa por tempo de voo (TOF MS) e as especificações do conversor analógico-digital (ADC). Os ADC de sinal frontal misto (MxFE®) demonstram que os ADC de baixo ruído e alta velocidade podem melhorar significativamente as métricas TOF MS, incluindo a precisão de massa, a resolução de massa e a sensibilidade.

Introdução à Espectrometria de Massas por Tempo de Voo
(TSMS): Esta técnica analítica permite quantificar moléculas conhecidas e desconhecidas numa amostra com base na sua massa molecular. Ao ionizar elementos e/ou moléculas da amostra em iões gasosos, com ou sem fragmentação, e ao separá-los num analisador de massas, os elementos e/ou moléculas são caracterizados pela sua relação massa/carga (m/z), ou localização do pulso, e abundância relativa, ou amplitudes do pulso, nos espectros de massa.
Um espectrómetro de massa é constituído por três componentes principais: a fonte de iões, que produz iões gasosos a partir da amostra em análise; o analisador de massas, que separa os iões de acordo com as suas relações m/z; e o detetor de iões, que deteta os iões e a abundância relativa de cada espécie iónica. O sinal do detetor é condicionado e digitalizado para gerar um espectro de massas. Existem diversos analisadores de massa com estratégias fundamentalmente diferentes para separar iões com diferentes valores de m/z. A Figura 1 mostra os principais componentes da espectrometria de massas quadrupolar e da espectroscopia de tempo de voo (TOF).
Na espectrometria de massas TOF, os iões formados por um evento de ionização curto são acelerados por um campo electrostático, de modo a que os iões com diferentes valores de m/z possuam a mesma energia cinética, mas velocidades diferentes. Os iões percorrem então uma trajetória de deriva livre de campo e chegam ao detetor com diferentes tempos de voo: os iões mais leves chegam antes dos mais pesados, como ilustrado na Figura 2. Na prática, o tempo de voo de um pacote de iões com o mesmo m/z é distribuído para formar um pulso que pode ser tão estreito como algumas centenas de picossegundos (ps) devido às diferenças nas distribuições espaciais iniciais e na energia (ou velocidade) na região de aceleração. Cada impulso é a soma dos sinais correspondentes a múltiplos eventos independentes de chegada de iões e é frequentemente caracterizado pelo parâmetro de largura total à meia altura (FWHM).

Figura 1. Blocos principais de MS quádruplo e TOF.

Figura 2: Ilustração de um analisador de massas por tempo de voo.

Um detetor, como um detetor de placa de microcanais (MCP), deteta iões incidentes e produz uma corrente elétrica pulsada. Esta corrente elétrica é registada através de um conversor tempo-digital (TDC) ou de um conversor digital-analógico (DAC) de alta velocidade. Embora o TDC possa ser extremamente rápido, atingindo alguns picossegundos, possui uma gama dinâmica limitada para o registo da amplitude do pulso. Os conversores analógico-digitais (ADCs) de alta velocidade podem atingir 2 ou mais gigasamples por segundo (GSPS) com uma resolução de 10 bits, 12 bits ou até superior, permitindo o registo preciso tanto da temporização como da amplitude do pulso. Discutiremos as especificações importantes dos ADC de alta velocidade que influenciam o desempenho da espectrometria de massa por tempo de voo (TOF).

Aplicações da Espectrometria de Massa por Tempo de Voo (TOF MS):
A tecnologia MALDI ioniza moléculas da matriz, tipicamente ácidos orgânicos, e vaporiza simultaneamente moléculas da amostra com impulsos de laser ultravioleta (UV) que variam entre centenas de picossegundos (ps) e alguns nanossegundos (ns). Na fase gasosa, as moléculas da matriz transferem protões para as moléculas da amostra, protonando-as e transformando-as em iões carregados. Como a matriz absorve a maior parte da energia do laser, as moléculas da amostra mantêm a sua integridade sem fragmentação ou decomposição, fazendo da MALDI o método de ionização mais eficaz para a análise de macromoléculas biológicas. Graças à fácil integração entre MALDI e TOF MS, à gama de massas ilimitada, à elevada sensibilidade e à elevada produtividade, a TOF MS tornou-se uma ferramenta essencial para a investigação biomédica, descoberta de fármacos e aplicações clínicas, onde os analitos são frequentemente macromoléculas.

Em particular, a espectrometria de massa MALDI-TOF desempenha um papel insubstituível na identificação clínica de bactérias, graças ao seu tempo de resposta mais rápido, de 4 horas, em comparação com mais de 72 horas para tecnologias convencionais ou outras tecnologias inovadoras. ³ Um tempo de resposta curto é crucial para os cuidados e resultados dos doentes que sofrem de infeções bacterianas. Outras vantagens da MALDI-TOF MS incluem a facilidade de preparação da amostra, os baixos custos operacionais e a capacidade de identificar algumas bactérias raras. Dado que a resistência antimicrobiana representa uma séria ameaça para a saúde humana em todo o mundo, existe uma tendência crescente para a utilização da MALDI-TOF MS como dispositivo de diagnóstico no local de prestação de cuidados. ⁴

Parâmetros-chave do TOF MS:
A capacidade do TOF MS de quantificar diferentes analitos em amostras de ensaio depende de muitos fatores, incluindo a escolha do método de ionização da amostra, a configuração e as características de temporização dos campos elétricos utilizados para acelerar e direcionar os iões para o detetor de iões, a eficiência do detetor e a digitalização do sinal. Limitaremos a nossa discussão às principais especificações do TOF MS relacionadas com a digitalização do sinal, incluindo a gama de massas, a precisão de massas, a resolução de massas, a taxa de repetição e a sensibilidade.
A gama de massas é a gama de pesos moleculares das moléculas da amostra e está relacionada com diversos fatores, como a tensão de aceleração, o comprimento do tubo de voo, a frequência de amostragem e a taxa de repetição. Os requisitos de gama de massa variam consoante a aplicação. Por exemplo, a identificação bacteriana utilizando o MALDI TOF MS mede marcadores ribossómicos na gama de massas de 2000 Da a 20000 Da.
Como a massa é calculada a partir do tempo de voo, a precisão da Espectrometria de Massa por Tempo de Voo (TOF) é determinada principalmente pela precisão das medições do tempo de chegada dos impulsos. Na prática, o tempo de chegada de cada pulso é calculado ajustando o pulso a uma função gaussiana e encontrando o pico. A taxa de amostragem do ADC determina o número de amostras para um pulso individual e é crucial para o ajuste do pulso.
A resolução de massa é uma medida da menor separação distinguível entre dois impulsos vizinhos no espectro. É frequentemente definida como a relação entre a massa do ião e a largura do pulso de massa correspondente. Uma definição típica da largura de pulso é a Massa Total à Meia Altura (FWHM). Quanto mais estreito for o pulso, maior será a resolução de massa, o que significa uma melhor diferenciação entre dois pacotes de iões com massas moleculares semelhantes. Embora a resolução de massa possa ser significativamente melhorada pela aceleração ortogonal e pelos refletores, a taxa de amostragem do ADC e o desempenho do ruído também afetam esta especificação fundamental.
Na espectrometria de massa por tempo de voo (TOF), o espectro de massa é a soma de sinais provenientes de múltiplas repetições, em vez de um único transitório, abrangendo uma única ionização, aceleração e deriva, para além do processo de deteção e digitalização de iões. Crucialmente, para amostras contendo múltiplas moléculas com diferentes pesos moleculares e concentrações, um único evento de ionização pode não produzir iões de todas as moléculas de interesse, nem em proporções compatíveis com as suas concentrações. A soma é um método eficaz e prático para reduzir este erro de amostragem e melhorar a relação sinal-ruído (SNR). Portanto, a taxa de repetição é uma especificação importante e prática da TOF MS para a SNR e produtividade.
Os instrumentos TOF MS mais recentes podem atingir uma velocidade de varrimento de 1 kHz ou superior, o que significa que cada transitório dura 1 milissegundo (ms) ou menos. O aumento da frequência de amostragem do ADC reduz a duração de cada transitório, resultando numa taxa de reposição mais rápida.
A sensibilidade da TOF MS é a capacidade de detetar moléculas com as concentrações mais baixas nas amostras. A sensibilidade do sistema é determinada coletivamente por diversos fatores, como o ruído químico de fundo, a gama de concentrações de todas as moléculas de interesse, a figura de ruído e a gama dinâmica do detetor e do conversor analógico-digital (ADC), e o número de transitórios adicionados para o espectro de massas final. Na prática, a sensibilidade do sistema pode ser otimizada identificando o fator limitante e/ou equilibrando esses fatores.

Especificações desejadas do ADC para TOF MS:
Um ADC de baixo ruído e alta velocidade é crucial para o desempenho de um sistema TOF MS. Como discutido anteriormente, a precisão temporal e o nível de ruído do sistema são duas especificações importantes para um instrumento TOF MS. Embora o ruído do sistema possa ser mitigado pela soma de medições repetidas, a precisão temporal é determinada pela taxa de amostragem e pela variação da abertura (jitter) do ADC de alta velocidade. Considerando que os impulsos podem ter uma duração de apenas algumas centenas de picossegundos num instrumento TOF MS com aceleração ortogonal e um refletor, existem apenas algumas amostras para um impulso individual a uma taxa de amostragem de 5 GSPS.
Cada amostra é crucial para encontrar o pico do pulso quando as amostras são ajustadas a uma função gaussiana. Assim sendo, a taxa de amostragem e a variação da abertura são especificações desejáveis ​​para o ADC.
A sensibilidade é determinada pelo nível de ruído do sistema, que pode ser melhorado pela soma de medições repetidas. No entanto, o número de repetições limita o desempenho do instrumento. O desempenho de ruído do ADC é importante para alcançar a sensibilidade desejada com menos repetições. Existe frequentemente uma conceção errónea sobre o desempenho de um ADC de que a sua relação sinal-ruído (SNR) é proporcional à sua resolução em bits. Os ADC com uma taxa de amostragem de 1 GSPS ou superior utilizam normalmente uma arquitetura pipeline e possuem especificações que incluem um número efetivo de bits (ENOB) e densidade de ruído/figura de ruído/SNR/etc. No entanto, os ADC em cadeia não conseguem atingir a resolução em bits devido a diversas desvantagens que contribuem para o ruído, como os amplificadores operacionais de alto ganho e alta largura de banda necessários para reduzir os erros, o desajuste dos condensadores e a dissipação de potência dos amplificadores operacionais e de amostragem e retenção (S/H) da entrada. ⁵ O ENOB depende da frequência de entrada e da taxa de amostragem e é calculado através da relação sinal-ruído e distorção (SNDR). Por exemplo, o AD9081 de 12 bits tem um ENOB de 8 bits a 4 GSPS com uma frequência de entrada de 4500 MHz. O ENOB não é uma boa medida do desempenho de ruído do ADC.
A densidade de ruído representa mais um passo em direção ao nível de ruído prático, mas os testes de bancada com impulsos gaussianos mantêm a verdade fundamental sobre o desempenho de ruído do ADC e, portanto, sobre a sensibilidade do instrumento TOF MS.

Teste de bancada de um ADC de baixo ruído e alta velocidade:
O MxFE oferece uma integração inteligente de ADCs de RF, conversores digital-analógico (DACs), processamento digital de sinal no chip e um circuito de clock/PLL (Phase-Locked Loop) para sincronização multi-chip. Componentes MxFE com apenas ADCs de alta velocidade também estão disponíveis. Por simplicidade, o nosso teste de bancada utilizou o AD9082, que possui ADCs e DACs integrados, como mostra a Figura 3. O DAC integrado foi utilizado para gerar o sinal de entrada. Este DAC gerou um trem de impulsos gaussianos estreitos com uma largura de banda à meia altura (FWHM) de 0,5 ns e amplitude controlada por uma combinação de escalonamento digital e atenuadores externos. Os impulsos gaussianos são muito mais próximos do sinal do espectro de massas do que o sinal de tom único típico utilizado para a caracterização de ADCs. Estão configurados dois canais ADC para digitalizar o sinal: CH1 para diversas amplitudes saturadas ou atenuadas, variando os atenuadores externos, e CH2 como referência para intensidade de sinal acima de 90% da escala completa (FS) sem saturação. A frequência de amostragem foi de 6 GSPS no nosso teste para obter amostras suficientes para cada pulso.

Figura 3. Diagrama de blocos para o teste do ADC de alta velocidade com o AD9082.

Foram realizados três tipos de ensaios:
Ensaios de atenuação e saturação: CH2 com um par de atenuadores fixos de 7 dB como referência; CH1 com atenuadores de 8 dB, 9 dB e 10 dB para os testes de atenuação e atenuadores de 3 dB e 1 dB para os testes de saturação.
Medição de sinais fracos com atenuação até 20 dB: CH2 ligado diretamente à saída do DAC como referência com escala de -16 dBFSC; CH1 com um par de atenuadores de 10 dB para o sinal.
Medição de ruído: CH2 com um par de atenuadores fixos de 7 dB como referência; CH1 com terminação de 50 Ω.
Para cada teste foram adquiridos dados com uma duração superior a 10 µs, e a aquisição de dados foi repetida 10 vezes para verificar a reprodutibilidade. Os dados foram plotados e analisados ​​no MATLAB®. As 10 repetições foram alinhadas e plotadas para cada caso de teste. A Figura 4 mostra um único impulso no teste, em que o canal CH1 se encontra 3 dB abaixo do canal CH2. As 10 repetições apresentaram uma boa sobreposição para ambos os canais, demonstrando a elevada reprodutibilidade da aquisição de dados.

Figura 4. A sobreposição das 10 repetições demonstrou uma elevada reprodutibilidade da aquisição de dados.

O ADC AD9082 possui um circuito de proteção contra sobrecarga, que é ativado se a amplitude de entrada exceder o limite superior. Uma cauda de recuperação ocorre geralmente no flanco descendente do impulso se o circuito de proteção estiver ativado, resultando num pico truncado à escala completa (FS) e numa cauda de recuperação.
Uma cauda de recuperação mais curta é importante para medições precisas de tempo de voo (TOF) e massa (TOF-MS). A Figura 5 mostra o gráfico de cinco casos com saturação (até 6 dB) ou atenuação.
Para testar o desempenho do ADC com uma entrada fraca, adquirimos o sinal atenuado a 10 dB e 20 dB, como mostra a Figura 6. O sinal limpo estava a 10% da escala completa (FS), ou atenuado a 20 dB, sugerindo ruído mínimo introduzido pelo ADC.
Para o ruído de fundo do ADC, o canal CH1 foi ligado com um terminador de 50 Ω, enquanto o canal CH2 permaneceu a >90% da escala completa (FS), como mostrado na Figura 7.
Analisámos os dados de ruído através do traçado do histograma e do cálculo do seu desvio padrão, como mostrado na Figura 8. O desvio padrão neste caso foi de 0,0025, sugerindo uma relação sinal-ruído (SNR) de 52 dB na escala completa.

Figura 5. Sobreposição dos 5 casos de teste com saturação ou atenuação excessiva.

Figura 6. Casos de teste com entrada atenuada a 10 dB e 20 dB.

Figura 7. Medição do ruído de fundo com o canal CH1 ligado a um terminador de 50 Ω.

Figura 8. Histogramas da medição do ruído de fundo (CH1, à esquerda) e do sinal FS (CH2, à direita).

Para quantificar ainda mais a precisão temporal e o desempenho do ruído, segmentámos cada pulso com o seu pico centrado numa janela de 30 ns. De seguida, ajustamos cada pulso a um modelo gaussiano para medir a sua largura de onda completa (FWHM). Utilizámos 12 ns de dados de cada lado, ou 24 ns no total, da janela de 30 ns como base para o cálculo do ruído.
A Figura 9 mostra o gráfico de aquisição completo para o caso de teste de pulso único, entrada com FS de 10%, zoom, com ajuste gaussiano e linha de base segmentada. A Tabela 1 mostra a FWHM média e medida e a relação sinal-ruído (SNR) calculada.

Figura 9. Segmentação de pulso e linha de base para a medição de FWHM e SNR para o caso de teste de entrada de 10% FS.

Tabela 1. Medições de FWHM e SNR para o caso de teste de entrada com FS de 10%

Tabela 2. Largura à meia altura (FWHM) e relação sinal-ruído (SNR) medidas

Discussão e Conclusão:
Com a consolidação da espectrometria de massa MALDI-TOF como padrão para a identificação bacteriana em laboratórios de microbiologia clínica e o crescente interesse na proteómica para a medicina personalizada, espera-se que a MALDI-TOF continue a sua trajetória de crescimento na área da saúde nas próximas décadas. A espectrometria de massa TOF tem também amplas aplicações na investigação biomédica e descoberta de fármacos, segurança alimentar e monitorização ambiental, devido à sua vantagem na análise de moléculas intactas com uma vasta gama de pesos moleculares. Com um desempenho superior em relação ao ruído e uma taxa de amostragem 3 a 6 vezes mais rápida do que os conversores analógico-digitais (ADCs) da atual geração de instrumentos TOF MS, o ADC de baixo ruído e alta velocidade é um componente crítico da próxima geração de instrumentos TOF MS de alto desempenho. A elevada taxa de amostragem permite um tamanho mais pequeno do instrumento TOF MS sem sacrificar o desempenho, uma vez que pode reduzir o comprimento do tubo de voo e, consequentemente, a carga no sistema de vácuo. Um tamanho mais pequeno é importante para aplicações em pontos de atendimento e diversas aplicações de campo da TOF MS.

O nosso teste de bancada com o AD9082 apresenta algumas limitações, incluindo a disponibilidade limitada de atenuadores externos para criar casos de teste com entradas de baixa amplitude (como 1% FS ou atenuação de 40 dB), incompatibilidade de impedância que causa reflexão de dados e espaço aberto sem blindagem contra interferências eletromagnéticas. A relação sinal-ruído (SNR) reportada nos casos de teste foi inferior ao valor real, uma vez que a reflexão da linha de base causada pela incompatibilidade de impedância não foi removida no cálculo do ruído. As placas de teste MxFE, juntamente com o software de interface gráfica do utilizador (GUI), estão disponíveis para testes mais intensivos. Instruções detalhadas, com o auxílio de uma demonstração ao vivo, podem facilitar a configuração do sistema de avaliação do cliente. A prototipagem com amostras MxFE é facilitada com a orientação de uma equipa de aplicação experiente.
A largura de banda à meia altura (FWHM) e a SNR medidas demonstram a precisão temporal e o desempenho de ruído superiores dos conversores analógico-digitais (ADCs) MxFE. A taxa de amostragem comercialmente disponível do MxFE, até 10 GSPS, oferece a flexibilidade necessária para conceber sensores MS TOF de próxima geração com precisão e resolução de massa melhoradas, maior sensibilidade e dimensões ainda mais reduzidas. Além disso, os conversores analógico-digitais (ADCs) MxFE são suportados por fontes de alimentação, produtos de sincronização e controladores que ajudam a garantir uma integração e otimização perfeitas do sistema.

Referências
1 Jurgen H. Gross. Espectrometria de Massas: Um Livro Didáctico, 3ª Edição. Springer, 2017.
2 Eva Torres-Sangiao, Cristina Leal Rodriguez e Carlos Garcia-Riestra. “Aplicação e Perspectivas da Espectrometria de Massas MALDI-TOF em Laboratórios de Microbiologia Clínica.” Microorganisms, Vol. 9, 2021.
3 Mohammad Y. Ashfaq, Dana A. Da'na e Mohammad A. Al-Ghouti. “Aplicação da Espectrometria de Massas MALDI-TOF para a Identificação de Bactérias Ambientais: Uma Revisão.” Journal of Environmental Management, Vol. 305, 2022.
4 E. Chabriere, H. Bassène, M. Drancourt e C. Sokhna. “MALDI-TOF MS e Point of Care são Ferramentas de Diagnóstico Disruptivas em África.” New Microbes and New Infections, Vol. 26 de fevereiro de 2018.
5 Chun C. Lee. Dissertação: Melhorando a Precisão e a Eficiência Energética de Conversores Analógico-Digitais Pipeline. Universidade de Michigan, 2010.
Sobre o autor:
Guixue (Glen) Bu é engenheiro de design/arquitetura de sistemas no Grupo de Soluções de Sistemas de Instrumentação, com foco em I&D no desenvolvimento e aplicações de instrumentação científica. Ingressou na Analog Devices em setembro de 2018. Obteve o seu diploma de bacharel em engenharia pela Universidade de Tsinghua e os seus títulos de mestrado e doutoramento pela Universidade de Purdue, todos em engenharia biomédica.

Autora: Guixue (Glen) Bu, Engenheira de Design de Sistemas na ADI