Questo articolo analizza la relazione tra i parametri della spettrometria di massa a tempo di volo (TOF MS) e le specifiche del convertitore analogico-digitale (ADC). I convertitori ADC a segnale frontale misto (MxFE®) dimostrano che i convertitori ADC a basso rumore e ad alta velocità possono migliorare notevolmente le metriche della TOF MS, tra cui l'accuratezza di massa, la risoluzione di massa e la sensibilità.

Introduzione alla spettrometria di massa a tempo di volo
(TSMS): si tratta di una tecnica analitica per la quantificazione di molecole note e sconosciute all'interno di un campione, basata sul peso molecolare. Ionizzando elementi e/o molecole presenti nel campione in ioni gassosi, con o senza frammentazione, e separandoli successivamente in un analizzatore di massa, gli elementi e/o le molecole vengono caratterizzati dal loro rapporto massa/carica (m/z), o posizione dell'impulso, e dalla loro abbondanza relativa, o ampiezza dell'impulso, negli spettri di massa.
Uno spettrometro di massa è costituito da tre componenti principali: la sorgente ionica per produrre ioni gassosi dal campione in esame, l'analizzatore di massa per separare gli ioni in base ai loro rapporti m/z e il rivelatore di ioni per rilevare gli ioni e l'abbondanza relativa di ciascuna specie ionica. L'uscita del rivelatore viene elaborata e digitalizzata per produrre uno spettro di massa. Esistono diversi analizzatori di massa con strategie fondamentalmente diverse per la separazione di ioni con diversi valori di m/z. La Figura 1 mostra i principali elementi costitutivi della spettrometria di massa quadrupolare (QMS) e della spettroscopia a tempo di volo (TOF).
Nella spettrometria di massa TOF, gli ioni formati da un breve evento di ionizzazione vengono accelerati da un campo elettrostatico in modo tale che gli ioni con diversi valori di m/z abbiano la stessa energia cinetica ma velocità diverse. Gli ioni percorrono quindi un percorso di deriva privo di campo e arrivano al rivelatore con tempi di volo differenti: gli ioni più leggeri arrivano prima di quelli più pesanti, come illustrato nella Figura 2. In pratica, il tempo di volo di un pacchetto di ioni con lo stesso m/z si distribuisce in modo da formare un impulso che può essere stretto anche di poche centinaia di picosecondi (ps) a causa delle differenze nelle distribuzioni spaziali iniziali e nell'energia (o velocità) nella regione di accelerazione. Ogni impulso è la somma di segnali corrispondenti a molteplici eventi di arrivo di ioni indipendenti ed è spesso caratterizzato dal parametro larghezza a metà altezza (FWHM).

Figura 1. Blocchi principali della spettrometria di massa quadrupolare e della spettrometria di massa a tempo di volo (TOF).

Figura 2: Illustrazione di un analizzatore di massa a tempo di volo.

Un rivelatore, come ad esempio un rivelatore a piastra a microcanali (MCP), rileva gli ioni in arrivo e produce una corrente elettrica pulsata. Questa corrente elettrica viene registrata utilizzando un convertitore tempo-digitale (TDC) o un convertitore digitale-analogico (DAC) ad alta velocità. Sebbene il TDC possa essere estremamente veloce, fino a pochi ps, ha una gamma dinamica limitata per la registrazione dell'ampiezza dell'impulso. I convertitori analogico-digitali (ADC) ad alta velocità possono raggiungere 2 o più gigacampioni al secondo (GSPS) con una risoluzione di 10 bit, 12 bit o anche superiore, consentendo una registrazione accurata sia della temporizzazione che dell'ampiezza dell'impulso. Discuteremo le specifiche importanti degli ADC ad alta velocità che influenzano le prestazioni della spettrometria di massa a tempo di volo (TOF).

Applicazioni della spettrometria di massa TOF:
la tecnologia MALDI ionizza le molecole della matrice, tipicamente acidi organici, e vaporizza simultaneamente le molecole del campione con impulsi laser ultravioletti (UV) che vanno da centinaia di ps a pochi nanosecondi (ns). In fase gassosa, le molecole della matrice trasferiscono protoni alle molecole del campione, protonandole e trasformandole in ioni carichi. Poiché la matrice assorbe la maggior parte dell'energia laser, le molecole del campione mantengono la loro integrità senza frammentazione o decomposizione, rendendo la MALDI il metodo di ionizzazione più efficace per l'analisi di macromolecole biologiche. Grazie al facile accoppiamento tra MALDI e TOF MS, all'intervallo di massa illimitato, all'elevata sensibilità e all'elevata produttività, la TOF MS è diventata uno strumento essenziale per la ricerca biomedica, la scoperta di farmaci e le applicazioni cliniche in cui gli analiti sono spesso macromolecole.

In particolare, la spettrometria di massa MALDI-TOF svolge un ruolo insostituibile nell'identificazione clinica dei batteri grazie al suo tempo di risposta più rapido di 4 ore, rispetto alle oltre 72 ore necessarie per le tecnologie convenzionali o altre tecnologie innovative.³ Un tempo di risposta breve è fondamentale per la cura e l'esito dei pazienti affetti da infezioni batteriche. Altri vantaggi della spettrometria di massa MALDI-TOF includono la facilità di preparazione del campione, i bassi costi operativi e la capacità di identificare alcuni batteri rari. Dato che la resistenza antimicrobica rappresenta una seria minaccia per la salute umana in tutto il mondo, si osserva una crescente tendenza all'utilizzo della spettrometria di massa MALDI-TOF come dispositivo point-of-care.⁴

Parametri chiave della spettrometria di massa TOF:
La capacità della spettrometria di massa TOF di quantificare diversi analiti nei campioni dipende da molti fattori, tra cui la scelta del metodo di ionizzazione del campione, la configurazione e le caratteristiche temporali dei campi elettrici utilizzati per accelerare e guidare gli ioni verso il rivelatore di ioni, l'efficienza del rivelatore e la digitalizzazione del segnale. Limiteremo la nostra discussione alle specifiche chiave della spettrometria di massa TOF relative alla digitalizzazione del segnale, tra cui l'intervallo di massa, l'accuratezza di massa, la risoluzione di massa, la frequenza di ripetizione e la sensibilità.
L'intervallo di massa è l'intervallo di pesi molecolari delle molecole del campione ed è correlato a diversi fattori, come la tensione di accelerazione, la lunghezza del tubo di volo, la frequenza di campionamento e la frequenza di ripetizione. I requisiti dell'intervallo di massa variano a seconda dell'applicazione. Ad esempio, l'identificazione batterica mediante MALDI TOF MS misura i marcatori ribosomiali nell'intervallo di massa da 2.000 Da a 20.000 Da.
Poiché la massa viene calcolata dal tempo di volo, l'accuratezza di massa della spettrometria di massa a tempo di volo (TOF) è determinata principalmente dall'accuratezza delle misurazioni della temporizzazione degli impulsi. In pratica, il tempo di arrivo di ciascun impulso viene calcolato adattando l'impulso a una funzione gaussiana e individuando il picco. La frequenza di campionamento dell'ADC determina il numero di campioni per un singolo impulso ed è fondamentale per l'adattamento dell'impulso. La
risoluzione di massa è una misura della minima separazione distinguibile tra due impulsi adiacenti nello spettro. Viene spesso definita come il rapporto tra la massa ionica e la larghezza del corrispondente impulso di massa. Una definizione tipica della larghezza dell'impulso è la massa a peso pieno (FWHM). Più stretto è l'impulso, maggiore è la risoluzione di massa, ovvero una migliore differenziazione tra due pacchetti di ioni con pesi molecolari simili. Sebbene la risoluzione di massa possa essere migliorata significativamente mediante accelerazione ortogonale e riflettori, anche la frequenza di campionamento dell'ADC e le prestazioni del rumore influenzano questa specifica chiave.
Nella spettrometria di massa a tempo di volo (TOF), lo spettro di massa è la somma dei segnali provenienti da molte ripetizioni anziché da un singolo transiente, comprendente un singolo processo di ionizzazione, accelerazione e deriva, e rilevamento e digitalizzazione degli ioni. È fondamentale notare che, per i campioni di analisi contenenti più molecole con pesi molecolari e concentrazioni variabili, un singolo evento di ionizzazione potrebbe non produrre ioni da tutte le molecole di interesse, né in proporzioni commisurate alle loro concentrazioni. La somma è un metodo efficace e pratico per ridurre questo errore di campionamento e migliorare il rapporto segnale/rumore (SNR). Pertanto, la frequenza di ripetizione è una specifica importante e pratica della spettrometria di massa TOF per l'SNR e la produttività.
Gli strumenti TOF MS più recenti possono raggiungere una velocità di scansione di 1 kHz o superiore, il che significa che ogni transiente dura 1 millisecondo (ms) o meno. Aumentando la frequenza di campionamento dell'ADC si riduce la durata di ogni transiente, consentendo una velocità di rifornimento più rapida.
La sensibilità della spettrometria di massa TOF è la capacità di rilevare molecole con le concentrazioni più basse nei campioni. Essa è determinata collettivamente da molti fattori, come il rumore chimico di fondo, l'intervallo di concentrazione di tutte le molecole di interesse, il fattore di rumore e la gamma dinamica del rivelatore e dell'ADC, e il numero di transienti sommati per lo spettro di massa finale. In pratica, la sensibilità del sistema può essere ottimizzata identificando il fattore limitante e/o bilanciando tali fattori.

Specifiche ADC desiderate per TOF MS:
Un ADC a basso rumore e ad alta velocità è fondamentale per le prestazioni di un sistema TOF MS. Come discusso in precedenza, la precisione della temporizzazione e il livello di rumore del sistema sono due specifiche importanti per uno strumento TOF MS. Mentre il rumore del sistema può essere attenuato sommando le misurazioni ripetute, la precisione della temporizzazione è determinata dalla frequenza di campionamento e dal jitter dell'apertura dell'ADC ad alta velocità. Considerando che gli impulsi possono essere stretti come poche centinaia di ps in uno strumento TOF MS con accelerazione ortogonale e riflettore, ci sono solo pochi campioni per un singolo impulso a una frequenza di campionamento di 5 GSPS.
Ogni campione è cruciale per trovare il picco dell'impulso quando i campioni vengono interpolati con una funzione gaussiana. Pertanto, la frequenza di campionamento e il jitter dell'apertura sono specifiche ADC desiderabili.
La sensibilità è determinata dal livello di rumore del sistema, che può essere migliorato sommando le misurazioni ripetute. Tuttavia, il numero di ripetizioni limita le prestazioni dello strumento. Le prestazioni di rumore dell'ADC sono importanti per ottenere la sensibilità desiderata con un minor numero di ripetizioni. Spesso si crede erroneamente che il rapporto segnale/rumore (SNR) di un ADC sia proporzionale alla sua risoluzione in bit. Gli ADC con una frequenza di campionamento di 1 GSPS o superiore utilizzano in genere un'architettura pipeline e presentano specifiche che includono il numero effettivo di bit (ENOB) e la densità di rumore/figura di rumore/SNR, ecc. Tuttavia, gli ADC a catena non possono raggiungere la risoluzione in bit perché presentano diversi svantaggi che contribuiscono al rumore, come gli amplificatori operazionali ad alto guadagno e ad alta larghezza di banda necessari per ridurre gli errori, il disallineamento dei condensatori e la dissipazione di potenza degli amplificatori operazionali front-end e sample-and-hold (S/H).⁵ L'ENOB dipende dalla frequenza di ingresso e dalla frequenza di campionamento e viene calcolato utilizzando il rapporto segnale/rumore e la distorsione (SNDR). Ad esempio, l'AD9081 a 12 bit ha un ENOB a 8 bit a 4 GSPS con una frequenza di ingresso di 4500 MHz. L'ENOB non è una buona misura delle prestazioni di rumore dell'ADC.
La densità di rumore si avvicina maggiormente al livello di rumore reale, ma i test al banco con impulsi gaussiani mantengono l'accuratezza fondamentale delle prestazioni di rumore del convertitore analogico-digitale (ADC) e, di conseguenza, della sensibilità dello strumento TOF MS.

Test al banco di un ADC a basso rumore e alta velocità:
MxFE offre un'integrazione intelligente di ADC RF, convertitori digitale-analogico (DAC), elaborazione del segnale digitale on-chip e un circuito di clock/PLL (Phase-Locked Loop) per la sincronizzazione multi-chip. Sono disponibili anche componenti MxFE con soli ADC ad alta velocità. Per semplicità, il nostro test al banco ha utilizzato l'AD9082, che integra ADC e DAC, come mostrato in Figura 3. Il DAC integrato è stato utilizzato per generare il segnale di ingresso. Questo DAC ha generato un treno di impulsi gaussiani stretti con un tempo di dimezzamento a lunghezza d'onda intera (FWHM) di 0,5 ns e un'ampiezza controllata da una combinazione di scalatura digitale e attenuatori esterni. Gli impulsi gaussiani sono molto più simili al segnale dello spettro di massa rispetto al tipico segnale a tono singolo utilizzato per la caratterizzazione degli ADC. Per la digitalizzazione del segnale sono configurati due canali ADC: CH1 per diverse ampiezze saturate o attenuate variando gli attenuatori esterni, e CH2 come riferimento per l'intensità del segnale superiore al 90% del fondo scala (FS) senza saturazione. La frequenza di campionamento utilizzata nei nostri test era di 6 GSPS per ottenere un numero sufficiente di campioni per ciascun impulso.

Figura 3. Diagramma a blocchi per il test del convertitore analogico-digitale ad alta velocità con l'AD9082.

Sono stati eseguiti tre tipi di test:
test di attenuazione e saturazione: CH2 con una coppia di attenuatori fissi da 7 dB come riferimento; CH1 con attenuatori da 8 dB, 9 dB e 10 dB per i test di attenuazione e attenuatori da 3 dB e 1 dB per i test di saturazione.
Misura di segnali deboli con attenuazione fino a 20 dB: CH2 collegato direttamente all'uscita del DAC come riferimento con scalatura -16 dBFSC; CH1 con una coppia di attenuatori da 10 dB per il segnale.
Misura del rumore: CH2 con una coppia di attenuatori fissi da 7 dB come riferimento; CH1 con terminazione da 50 Ω.
Per ogni test, sono stati acquisiti dati >10 µs e l'acquisizione dei dati è stata ripetuta 10 volte per verificarne la riproducibilità. I ​​dati sono stati rappresentati graficamente e analizzati in MATLAB®. Le 10 ripetizioni sono state allineate e rappresentate graficamente per ogni caso di test. La Figura 4 mostra un singolo impulso nel test in cui CH1 è 3 dB inferiore a CH2. Le 10 ripetizioni si sono sovrapposte in modo uniforme per entrambi i canali, a dimostrazione dell'elevata riproducibilità dell'acquisizione dei dati.

Figura 4. La sovrapposizione delle 10 ripetizioni ha dimostrato un'elevata riproducibilità dell'acquisizione dei dati.

Il convertitore analogico-digitale (ADC) AD9082 è dotato di un circuito di protezione da sovraccarico, che si attiva se l'ampiezza del segnale in ingresso supera il limite superiore. Se il circuito di protezione si attiva, si verifica spesso una coda di recupero sul fronte di discesa dell'impulso, con conseguente troncamento del picco a FS e della coda di recupero.
Una coda di recupero più corta è importante per misurazioni accurate del tempo di volo (TOF) e della massa. La Figura 5 mostra il grafico di cinque casi con saturazione (fino a 6 dB) o attenuazione.
Per testare le prestazioni dell'ADC con un segnale di ingresso debole, abbiamo acquisito il segnale attenuato di 10 dB e 20 dB, come mostrato in Figura 6. La traccia del segnale pulito era al 10% di FS, ovvero attenuata di 20 dB, il che suggerisce un rumore minimo introdotto dall'ADC.
Per il rumore di fondo dell'ADC, CH1 è stato collegato con un terminatore da 50 Ω, mentre CH2 è rimasto a >90% FS, come mostrato in Figura 7.
Abbiamo analizzato i dati del rumore tracciando l'istogramma e calcolandone la deviazione standard, come mostrato in Figura 8. La deviazione standard in questo caso era di 0,0025, il che suggerisce un SNR di 52 dB a FS.

Figura 5. Sovrapposizione dei 5 casi di test con saturazione o sovraattenuazione.

Figura 6. Casi di prova con segnale in ingresso attenuato di 10 dB e 20 dB.

Figura 7. Misura del rumore di fondo con CH1 collegato a un terminatore da 50 Ω.

Figura 8. Istogrammi della misurazione del rumore di fondo (CH1, a sinistra) e del segnale FS (CH2, a destra).

Per quantificare ulteriormente la precisione temporale e le prestazioni in termini di rumore, abbiamo segmentato ciascun impulso con il suo picco centrato all'interno di una finestra di 30 ns. Abbiamo quindi adattato ciascun impulso a un modello gaussiano per misurarne la larghezza a metà altezza (FWHM). Abbiamo utilizzato 12 ns di dati su entrambi i lati, per un totale di 24 ns, della finestra di 30 ns come baseline per il calcolo del rumore.
La Figura 9 mostra il grafico di acquisizione completo per il caso di test zoom-in con impulso singolo, ingresso FS al 10%, adattamento gaussiano e baseline segmentata. La Tabella 1 mostra la FWHM media e misurata e il rapporto segnale/rumore (SNR) calcolato.

Figura 9. Segmentazione dell'impulso e linea di base per la misurazione di FWHM e SNR per il caso di test con input FS al 10%.

Tabella 1. Misurazione di FWHM e SNR per il caso di test con input FS al 10%

Tabella 2. FWHM e SNR misurati

Discussione e conclusione:
Con l'affermazione della spettrometria di massa MALDI-TOF come standard per l'identificazione batterica nei laboratori di microbiologia clinica e il crescente interesse per la proteomica nella medicina personalizzata, si prevede che la spettrometria di massa MALDI-TOF continuerà a crescere nel settore sanitario nei prossimi decenni. La spettrometria di massa TOF trova inoltre ampie applicazioni nella ricerca biomedica e nella scoperta di farmaci, nella sicurezza alimentare e nel monitoraggio ambientale, grazie alla sua capacità di analizzare molecole intatte con un'ampia gamma di pesi molecolari. Grazie alle prestazioni superiori in termini di rumore e a una frequenza di campionamento da 3 a 6 volte più veloce rispetto ai convertitori analogico-digitali (ADC) degli strumenti TOF MS di ultima generazione, l'ADC a basso rumore e ad alta velocità rappresenta un componente fondamentale per la prossima generazione di strumenti TOF MS ad alte prestazioni. L'elevata frequenza di campionamento consente di ridurre le dimensioni dello strumento TOF MS senza comprometterne le prestazioni, poiché può ridurre la lunghezza del tubo di volo e, di conseguenza, il carico sul sistema del vuoto. Un ingombro ridotto è importante per le applicazioni point-of-care e per le diverse applicazioni sul campo della spettrometria di massa TOF.

Il nostro test al banco AD9082 presenta alcune limitazioni, tra cui la disponibilità limitata di attenuatori esterni per la creazione di casi di test con ingressi a bassa ampiezza (come l'1% FS, o un'attenuazione di 40 dB), il disadattamento di impedenza che causa riflessioni dei dati e la presenza di spazi aperti senza schermatura dalle interferenze elettromagnetiche. Il rapporto segnale/rumore (SNR) riportato per i casi di test era inferiore al valore effettivo perché la riflessione della linea di base causata dal disadattamento di impedenza non è stata rimossa nel calcolo del rumore. Sono disponibili schede di test MxFE con software di interfaccia utente grafica (GUI) per test più intensivi. Istruzioni dettagliate con l'ausilio di una dimostrazione dal vivo possono facilitare la configurazione del sistema di valutazione del cliente. La prototipazione con campioni MxFE è semplice con la guida di un team di applicazioni esperto.
La FWHM e l'SNR misurati dimostrano la precisione temporale e le prestazioni di rumore superiori degli ADC MxFE. La frequenza di campionamento disponibile in commercio per MxFE, fino a 10 GSPS, offre la flessibilità necessaria per progettare sensori MS TOF di nuova generazione con precisione e risoluzione di massa migliorate, maggiore sensibilità e un ingombro ancora più ridotto. Inoltre, i convertitori analogico-digitali MxFE sono supportati da alimentatori, prodotti di sincronizzazione e controller che contribuiscono a garantire una perfetta integrazione e ottimizzazione del sistema.

Riferimenti
1 Jurgen H. Gross. Spettrometria di massa: un libro di testo, 3a edizione. Springer, 2017.
2 Eva Torres-Sangiao, Cristina Leal Rodriguez e Carlos Garcia-Riestra. "Applicazione e prospettive della spettrometria di massa MALDI-TOF nei laboratori di microbiologia clinica". Microorganisms, Vol. 9, 2021.
3 Mohammad Y. Ashfaq, Dana A. Da'na e Mohammad A. Al-Ghouti. "Applicazione della MALDI-TOF MS per l'identificazione di batteri ambientali: una revisione". Journal of Environmental Management, Vol. 305, 2022.
4 E. Chabriere, H. Bassène, M. Drancourt e C. Sokhna. "MALDI-TOF MS e Point of Care sono strumenti diagnostici dirompenti in Africa". New Microbes and New Infections, Vol. 26, 2018.
5 Chun C. Lee. Tesi di dottorato: Miglioramento dell'accuratezza e dell'efficienza energetica dei convertitori analogico-digitali per pipeline. Università del Michigan, 2010.
Informazioni sull'autore:
Guixue (Glen) Bu è un ingegnere di progettazione/architettura di sistemi presso l'Instrumentation System Solutions Group, specializzato in ricerca e sviluppo nello sviluppo e nelle applicazioni di strumentazione scientifica. È entrato a far parte di Analog Devices nel settembre 2018. Ha conseguito la laurea triennale in ingegneria presso l'Università di Tsinghua e la laurea magistrale e il dottorato di ricerca presso l'Università di Purdue, tutti in ingegneria biomedica.

Autore: Guixue (Glen) Bu, Ingegnere progettista di sistemi presso ADI